睡眠时的局部目标记忆再激活 [复制链接]

摘要

通过目标记忆再激活（targetedmemoryreaction，TMR）实现记忆巩固，TMR在睡眠期间重现训练线索或是内容。但是不清楚TMR对睡眠皮层振荡的作用是局部的还是整体的。本文利用嗅觉的独特功能神经解剖学及其同侧刺激处理，在一个脑半球进行局部TMR。在最初就有气味刺激条件下，受试者学习单词与出现在左右视野中的位置间的联系。本文发现在任务训练期间，侧向的时间相关电位表示单半球的记忆过程。在学习后的小睡中，在非快速眼动（non-rapideyemovement，NREM）睡眠中进行气味刺激。在睡眠期间进行局部TMR后，cued半球（与受刺激鼻孔同侧）处理特定单词的记忆得到改善。单侧气味刺激调控局部慢波（slow-wave，SW）功率，即相较于uncued半球，cued半球的区域SW功率增加较慢，且与提示单词的选择记忆呈负相关。另外，在cued半球中，局部TMR改善了慢震荡和睡眠纺锤波间的相位振幅耦合（PAC）。在学习期间没有气味刺激条件下，睡眠期间进行单侧气味刺激，结果表明记忆表现和皮层睡眠振荡间并不存在任何效应。因此，睡眠中TMR通过选择性地促进与局部睡眠振荡相关的特定记忆，而超过了整体活动。

引言

研究表明，睡眠对记忆巩固很重要，在清醒时编码的新的和不稳定的记忆转化为不太稳定的表征，这些表征被整合到预先存在的知识中。根据系统整合的标准模型以及它的一些后续变化，依赖海马记忆的整合发生在两阶段的过程中，其中清醒时，在海马中编码新的记忆，然后在涉及与新皮质的交互过程（主要在非快速眼动（NREM）睡眠期间）中进一步巩固。这种海马-新皮质间的通信可能涉及新皮质慢波（SWs）、丘脑-皮质睡眠纺锤波和海马尖波涟漪（SWRs）间的协调耦合。根据这个模型，皮层SW上行状态促使海马SWR和神经元的重新激活。海马重新激活诱导延迟的皮质反应，促进向逐渐增强的依赖新皮质的转变。同时，睡眠纺锤波为皮层回路提供可塑性。因此，SW-spindle-SWR事件的分层嵌套可能会促进从新激活的海马记忆向各自的新皮质网络发生转化。

有研究表明，在NREM睡眠期间的记忆巩固可以通过重新的刺激（如，与学习期间进行特定气味或声音）进行外部调节。“目标记忆再激活（TMR）”这种方法可以促进记忆巩固并诱导海马活动，这表明涉及重新激活新的记忆或其中一部分。虽然气味和声音都是有效刺激，但气味的好处是很少唤醒睡眠受试者。

然而，TMR中一个主要没有解决的问题是，选择性记忆对皮层睡眠振荡产生的影响是局部的还是整体的。目前并不清楚潜在的局部效应，为了克服这个问题，理想情况下，人们会在选定的皮层区域进行特定刺激，而将其他区域的同步活动作为控制。有研究明确了局部睡眠振荡的概念及其与记忆巩固的关系。因此，原则上，皮层睡眠振荡可能因局部TMR区域而存在差异。

为了对与特定大脑区域活动相关的特定记忆进行TMR，本文利用嗅觉系统的独特功能神经解剖学，其刺激处理主要是同侧的。嗅觉记忆是可以存储在一个半球中，只有通过连合通路才能进入另一半球。由于在NREM睡眠期间跨皮质区域的有效连接减少，本文假设睡眠期间跨皮质半球的整合可能会受到损伤。因此，本文预测在睡眠中向单个鼻孔进行气味刺激会增强记忆并调节同侧半球相关的睡眠振荡。

基于上述理论，本文在睡眠时通过对单个鼻孔进行气味刺激来局部激活单个半球的记忆（图1）。这种方法可以评估局部刺激对相应半球的行为记忆和电生理影响，而与另一半球相关的记忆和活动作为对照组（图1A）。本文使用了一个空间记忆任务，该任务需要对单词和左右视觉特定位置间的配对联系进行编码，这些联系与对侧大脑半球的处理相关（图1C、1D和1F）。结果表明，通过单侧嗅觉刺激在睡眠中的局部TMR超过了整体效应，并改善了与局部皮层睡眠振荡相关的选择性记忆。

图1实验设计。（A）试验过程的时间示意表。（1）受试者首先在对两个鼻孔进行气味刺激的情况下，学习word-location关联。（2）学习后，立刻进行记忆测试。（3）受试者在实验室小睡（~1-2h）。在NREM睡眠期间，通过特制面罩对单个鼻孔进行气味刺激。（4）睡眠后，进行记忆测试。（B）从左到右：学习期，对两个鼻孔进行气味刺激；在记忆测试期，不带面罩和没有气味刺激；睡眠期，进行单个鼻孔气味刺激；记忆测试期，不带面罩和没有气味刺激。（C）学习实验的时间线。单词依次出现在屏幕中心，并朝八个圆形目标之一移动。（D）记忆测试时间线。单词依次出现在屏幕中央，受试者使用光标选择与每个单词相关的目标位置。绿色虚线表示示例光标的轨迹。（E）“单侧鼻孔面罩”展示。（F）术语说明：睡眠期间，气味传递到cued鼻孔（本例中是右鼻孔）。同侧半球就是cued半球（嗅觉通路主要是同侧的）。学习过程中，与cued半球对侧视野中的目标位置（本例中是左侧视野中的目标）相关联的单词是cued单词（视觉通路主要是对侧的）。（G）对照实验的时间示意表。在没有任何嗅觉刺激的情况下进行记忆编码，随后在睡眠期间进行单侧气味刺激。

结果

在睡眠期间通过单侧嗅觉刺激进行TMR，以探究它如何影响提示记忆和相应的局部睡眠振荡。本文使用cued/uncued半球来分别指睡眠期间受刺激鼻孔的同侧/对侧半球。cued/uncued单词分别表示在cued半球的对侧/同侧视觉呈现的单词刺激，本文预测单侧提示能改善主要在刺激鼻孔半球处理的记忆巩固，呈现在对侧视觉（图1F）。气味和单个单词的处理不仅限于一个半球。因此，本文还进行了一项对照实验，受试者在没有气味刺激的情况下进行记忆编码，然后在睡眠期间进行单侧嗅觉刺激（图1G）。该对照实验可以确定哪些行为和电生理效应源于睡眠中的单侧嗅觉刺激和由单侧TMR引起的。

学习时的侧化EEG活动表明单半球记忆过程

首先，本文测试了任务是否在记忆编码期间引发了侧化脑活动。随后，本文检测了任务学习期间的脑电图（EEG）（图1A-1C中的记忆编码）是否显示侧化活动及其随学习过程的动态。本文采集30名受试者（参与对照实验）的EEG数据，他们记住了在六轮学习中重复的32个word-location关联。比较了每个单词目标位置的对侧/同侧中央电极（C3和C4）中的事件相关电位（ERP），在前三轮（“早期学习”）和后三轮（“后期学习”）学习中分别进行实验。本文发现对侧和同侧ERP的振幅在早期和后期学习轮次中显著不同，表明在任务学习期间存在侧化EEG活动（图2A和2B；早期：t=8.，p10-5；后期：t=8.，p-5；Monte-Carlopermutationtest[MCPT]）。随后测试三个不同的实验期，以检验它们对这种效应的贡献：单词出现在屏幕中心（0-ms）；单词朝目标位置移动（目标放大+单词移动；-ms）；单词到达目标位置（-ms）。在早期和后期学习轮次，对侧和同侧ERPs只有在单词移动（图2A；t=3.；p=0.）和单词到达目标位置期间（t=11.；p10-5；MCPT）存在显著性差异，可能表明了当单词移动并到达目标位置时的侧化视觉处理。然而，在后期学习轮次中，对侧和同侧ERPs在三种不同实验期都存在显著性差异（图2B，单词在屏幕中心：t=2.，p=0.；单词移动：t=6.，p=-4；单词到达目标位置：t=9.，p10-5）。重要的是，侧化性在后期学习实验中出现得更早，并在单词移动前/间更明显（图2C和2D；单词在屏幕中心和移动期间的-ms，t=2.，p=0.andt=2.，p=0.；MCPT）。因此，在后期学习阶段，一旦发生一些学习行为，EEG就会显示出更早的侧化活动，此时单词还在屏幕中心。这种较早的侧化现象解释了单词与其左/右视野中的相应位置间的关联的电生理关系。额叶和顶枕叶EEG显示相似的结果。总之，本文在任务期间发现EEG的明显侧化随学习过程而增加，与假设一致，即任务涉及单半球记忆过程。

图2任务学习期间的EEG侧化性。（A）在每次实验中，同侧电极（粉色）和对侧电极（绿色）的学习任务的前三轮中，中央EEGERP（n=30）时间锁定到单词呈现。阴影表示标准错误。*色突出显示同侧和对侧ERP之间存在显著性差异的区域（p0.05）。（B）与（A）相同，只不过是表示后三轮学习。在后期学习期间，同侧和对侧ERP出现更早的差异。（C）早期学习和后期学习轮次的ERP侧向比较（同侧和对侧ERP间差异的均方根[RMS]）。（D）分别在学习任务的早期（亮绿圈）和后期（暗绿圈）学习轮次中的单词在屏幕中心（-ms）和目标放大及单词移动（-ms）条件下，每个受试者数据的同侧和对侧ERP间的平均误差（红条）。后期学习轮次的同侧和对侧ERP间的差异更大，反映了侧化记忆过程。

睡眠时的局部TMR选择性地改善大脑半球相关记忆

立即评估训练后（pre-sleep）和小睡后（post-sleep，~2.5h）的word-location关联的记忆（~5min）。为了测试TMR对cued单词记忆的影响，本文进行了一项双向重复测量方差分析，包括时间条件（pre-sleep/post-sleep）和线索条件（cued/uncued）。发现时间（F(1，18)=2.；p=0.）和线索（F(1，18)=0.；p=0.）都不存在显著性效应，但是时间和线索间存在显著的交互作用（F(1，18)=8.；p=0.）。这种相互作用反映了对cued单词的记忆维持（two-tailedpairedttest；t(18)=-0.；p=0.），但是对uncued单词的记忆在睡眠后显著降低（two-tailedpairedttest；t(18)=2.；p=0.；effectsize：Cohen’sd=0.）。非参数统计进一步证实了对cued单词（Wilcoxonsign-rank=48.5；Z=-1.；p=0.）的记忆是稳定的，而对uncued单词的记忆下降（Wilcoxonsign-rank=；Z=-2.；p=0.；effectsize：rankbiserialcorrelation[RBC]r=0.）。为了进一步评估记忆表现，将每个受试者的post-sleep记忆表现归一化为pre-sleep表现（setto%）。结果（图3A）表明，睡觉后，对cued单词的记忆（mean）比uncued单词（mean）的记忆更好（t(18)=3.05，p=0.，effectsize：Cohen’sd=0.；Wilcoxonsign-rank=，Z=2.，p=0.，effectsize：RBCr=0.），在大多数受试者中都是这样（13/19）。

相比之下，对照实验中的单侧气味刺激没有表现出显著的行为效应。由于一名受试者的异常分数（图3C中用黑色标出），使分布偏离了正态，本文报告了除他之外的数据的参数检验，以及包括该受试者的非参数检验。双向重复测量ANOVA显示在时间和嗅觉刺激间不存在显著的相互作用（F=1.74；p=0.）。“cued”（mean）和“uncued”（mean）单词间的归一化post-sleep记忆表现不存在显著性差异。对cued和uncued单词的记忆进行非参数检验同样没有显著性差异（图3C；Wilcoxonsign-rank=40；Z=-1.；p=0.）。为了确定本文观察到的行为效应是由单侧TMR操作引起的，本文进行了混合ANOVA，将实验（TMR/control）和视野（cued/uncued）作为参数，发现二者间存在显著的相互作用（F(1,36)=9.；p=0.）。通过非参数检验来比较每个受试者在不同实验中的视野得分的差异，这种相互作用也是显著的（Z=3.；rankedsum=；p=0.；Wilcoxonrankedsumtest）。

本文通过主观评分测量了睡眠后气味的感知强度，以测试睡眠期间的气味刺激是否会影响其他认知方面。在TMR实验中，感知气味强度与N2睡眠期间的30s气味刺激的数量成正相关（参数：rp=0.，p=0.；非参数：rs=0.，p=0.；图3B）。而对照组实验中并不存在相关性（参数：rp=0.，p=0.；非参数：rs=0.，p=0.；图3D）。本文还证实了，不论是左鼻孔还是右鼻孔提示，或是左视野和右视野的关联间，记忆表现都没有显著差异。

总之，行为结果表明，当气味在学习过程中作为刺激并在睡眠中重新单侧呈现时，它会影响气味的表现并改善与特定半球处理相关的记忆。

图3睡觉期间，单侧气味刺激的行为效应。（A）在TMR实验中，cued单词（紫色，左）和uncued单词（灰色，右）的post-sleep记忆测试。用线连接的圆圈表示每个受试者的数据。黑线表示对cued单词的记忆更好（13/19名受试者）；虚线表示对uncued单词的记忆更好。（B）TMR实验中，睡眠后主观气味强度等级间的相关性（y轴）是N2睡眠期间30s气味刺激时期（cues）数量（x轴）的函数。（C）对照实验中的cued单词（紫，左）和uncued单词（灰，右）的post-sleep记忆测试的比较并没有显著效应。（D）对照试验中，睡眠后的主观气味强度等级（y轴）是N2睡眠时期30s气味刺激时期（cues）的数量（x轴）的函数，但是并没有相关性。

睡眠期间的局部TMR调节跨半球的EEGSW和纺锤波频率

为了测试单侧气味刺激是如何调节皮质睡眠振荡的，本文首先评估了30s气味刺激时期（“odor-on”）较基线时期（“odor-off”）的EEG频谱功率改变（图4A和4E）。在脑电中央电极上，本文发现气味刺激显著增加了两个半球和两个实验的SW（0.5-4Hz）功率（TMR实验，图4B；cued半球：Wilcoxonsign-rank=，Z=1.，p=0.，effectsize:RBCr=0.；uncued半球：Wilcoxonsign-rank=，Z=2.，p=0.01，effectsize：RBCr-0.；对照实验，图4F：cued半球：Wilcoxonsign-rank=，Z=2.，p=0.，effectsize：RBCr=0.；uncued半球：Wilcoxonsign-rank=，Z=3.，p=0.，effectsize：RBCr=0.）。

仅在TMR实验中，两个半球的纺锤波（12-16Hz）功率明显增加（图4B和4F：cued半球：Wilcoxonsign-rank=，Z=2.，p=0.01，effectsize：RBCRBC-r=0.；uncued半球：Wilcoxonsign-rank=，Z=2.，p=0.，effectsize：RBCRBC-r=0.）。对照实验中，单侧嗅觉刺激并不会显著调节纺锤波功率。因此，SW功率受嗅觉刺激影响，而纺锤体功率仅在涉及记忆再激活时升高。

随后，本文使用两种方式测试了cued半球和uncued半球间的功率差异：首先，TMR实验中，cued半球较uncued半球的SW功率呈现少量增加（Wilcoxonsign-rank=31；Z=-2.；p=0.01；effectsize：RBCr=-0.）。对照实验显示同样的结果（图4G；Wilcoxonsign-rank=47；Z=-1.；p=0.；effectsize：RBCr=-0.）。将SW分为SO和delta波表明，在uncued半球中更高的功率受delta波（1-4Hz）升高的影响（TMR实验：Wilcoxonsign-rank=34，Z=-2.，p=0.，effectsize：RBCr=-0.；对照组实验：Wilcoxonsign-rank=29，Z=-2.，p=0.，effectsize：RBCr=-0.）。两半球间的基线水平都没有显著差异，表明cued半球中的较低SW功率不受基线调节。两半球间的纺锤波功率增加没有显著性差异。其次，使用cluster-basedpermutationacrosstime-frequencybins比较由气味刺激引起的半球间的功率改变。在TMR实验中，发现在气味刺激的13-20s期间，uncued半球存在一个明显具有高SW功率的cluster（图4A中的红圈：clusterstatistics=-.；p=0.），对照组实验中并没有显著的clusters（图4E）。

为了评估实验类型（TMR/control）和半球（cued/uncued）间的交互作用，从每个受试者的uncued侧减去cued侧的SW功率增加，并比较实验间的这些差异分数。本文发现纺锤波功率升高存在显著性相互作用（Z=-2.；ranked-sum=；p=0.；Wilcoxonrank-sumtest；使用Wilcoxonrank-sumtest在SW中并没有发现交互作用）且在额叶电极的SW的相互作用存在显著cluster（clusterstatistics=-.；p=0.；two-sampleclusterpermutationtest；在中央电极或测试纺锤波时并没有显著的cluster）。这些结果表明，半球间的EEG功率差异由单侧TMR引起的。

在TMR实验中，本文发现SW功率改变和记忆间存在关系，在cued半球的SW功率和对cued单词的记忆提高呈负相关（rs=-0.49；p=0.；图4D）。因此，在cued半球中SW功率越低，关联记忆越好。相反，在uncued半球中气味引起的SW功率与对uncued单词的记忆提高没有相关性（rs=0.；p=0.）。在SO频段（对cued单词的记忆和cued半球的SO功率：rs=-0.，p=0.；对uncued单词的记忆和uncued半球中的SO功率：rs=0.，p=0.5；使用one-tailFisherr-to-ztransformation计算相关性间的差异：z=-2.，p=0.），SW功率和记忆的相关性更强，但不包含delta波。在对照实验中，睡觉期间的功率改变和记忆表现没有任何相关性（图4H）。

因此，在TMR实验中，气味刺激差异性的调节cued和uncued半球中的SW功率，cued半球中越低的SW功率增加与该半球选择cued单词处理的记忆相关。

图4睡眠期间单侧气味刺激引起的EEG功率改变。（A-D）为TMR实验中的结果。（A）睡眠期间气味刺激引起的cued（左）和uncued（右）半球的中央EEG功率改变的时频分解（在个时期和19名受试者中取平均）。黑条表示30s的气味刺激。红圈表示半球间存在显著差异。（B）SW（左）和纺锤波（右）活动中中央EEG的功率改变，对两个半球取平均。白圈表示受试者。（C）在cued半球（紫，左）和uncued半球（灰，右）的SW功率的平均变化。实线/虚线分别表示在cued半球具有较低/较高的功率。（D）对cued单词的post-sleep记忆的回归散点图（pre-sleep基线的百分比；y轴）和在气味刺激期间的cued半球的SW功率（基线的SD；x轴），二者呈负相关。（E-H）为对照组实验结果。（E）对照试验中，在睡眠期间有气味刺激引起的对cued（左）和uncued（右）的中央EEG功率变化的时频分解（n=时期和19名受试者）。（F）对两个半球的上的中央EEGSW（左）和纺锤波（右）取平均，得到对照实验的功率变化。气味刺激不会提高纺锤波功率。（G）对照实验中，SW功率在cued半球（紫，左）和uncued半球（灰，右）的平均变化。（H）气味刺激期间，对cued单词的post-sleep的回归散点图和cued半球中的SW功率，显示二者没有显著相关性。

在睡眠期间，局部TMR跨半球差异性调节SOs和纺锤波间的相位振幅耦合

本文测试了单侧气味刺激是否会影响睡眠纺锤波和前额电极SO上行状态间的相位振幅耦合（PAC），这和记忆巩固有关。通过分析在气味刺激期间SOs的典型相位，本文发现纺锤波紧挨着SO上行状态（图5A；平均优选相位值为0，所有试验和电极中，相位范围为-67°和15°之间）。Rayleightestfornon-uniformity证实存在紧密的SO-spindle耦合（TMR实验，cued半球：Z=7.，p=1.×10-4；uncued半球：Z=8.66，p=5.×10-5；对照组实验，cued半球：Z=5.18，p=0.；uncued半球：Z=4.，p=0.）。

为了评估单侧气味刺激如何影响PAC，本文在每个实验中分别比较了半球间的SO-spindlePAC（图5B和5C）。本文使用一种within-subject、within-session的方法，将cued半球的PAC和同时出现在uncued半球的PAC进行比较。使用参数和非参数circulardata2-sample测试，来测试半球间标准化优选相位的差异。本文发现，在TMR实验中，优选相位存在显著性差异（Watson-Williamstest：F=10.，p=0.；